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中新网北京8月4日电(记者孙自法)在生命科学领域，基因组编辑技术的迅速发展和广泛应用，为基础研究和应用开发提供强大的技术支撑。不过，大片段DNA(脱氧核糖核酸)编辑一直面临重大挑战，对数千乃至数百万碱基的精准操纵更是基因编辑领域的核心难题，备受关注。
育种和基因治疗有巨大应用潜力
来自中国科学院遗传与发育生物学研究所(遗传发育所)的消息说，该所高彩霞研究员团队最新研发出一种新型可编程的染色体编辑技术(ProgrammableChromosomeEngineering，PCE)。该技术在动植物中实现了从千碱基到兆碱基级别DNA的多类型染色体精准操纵，显著提升了真核生物基因组的操纵尺度和能力。
利用大片段DNA精准操纵技术，研究人员不仅能实现多基因叠加编辑，还可通过操控基因组结构变异，为作物性状改良和遗传疾病治疗开辟新路径。同时，该技术有望推动新型育种策略的发展，例如通过操纵遗传连锁、调控重组频率实现育性控制，以及消除连锁累赘，充分释放野生种质资源中优异等位基因的育种潜力。此外，精准染色体编辑技术的突破将加速人工染色体构建，在合成生物学等新兴领域也有重要的应用前景。
这项攻克大片段DNA精准编辑的重要成果论文，北京时间8月4日深夜在国际知名学术期刊《细胞》(Cell)上线发表。审稿人评价认为，中国团队发表的研究工作，代表了基因工程领域的重大突破，在育种和基因治疗方面具有巨大的应用潜力。
系统应用受到3个关键问题制约
论文通讯作者高彩霞研究员介绍说，以基因编辑工具CRISPR及其衍生技术为代表的编辑系统，通过可编程的向导RNA(核糖核酸)引导Cas9等核酸酶靶向基因组特定位点，已广泛应用于特定碱基和短片段DNA的精准编辑。但针对大片段DNA编辑，现有工具在编辑效率、尺度、精准性及类型多样性等方面仍存在明显不足。
研究团队发现，位点特异性重组酶(Cre-Lox)系统具有染色体水平DNA操纵潜力，其原理是在基因组中引入Lox序列后，由Cre重组酶介导Lox位点之间的DNA重组来实现全基因组范围内的遗传操纵。
然而，Cre-Lox系统的应用受到3个关键问题的制约：Lox位点固有的对称性导致重组反应可逆，不利于目的编辑的发生；Cre酶作为四聚体工作，提升其活性的工程改造难度高；重组后特异性位点残留，影响编辑的精准性。
构建两个可编程染色体编辑系统
高彩霞指出，为逐一突破上述限制，在本项研究中，研究团队构建出系统性技术路径：首先，开发高通量重组位点快速改造平台，并提出不对称Lox位点设计原则，成功创制新型Lox变体，保持高效重组效率的同时将可逆重组活性降低至阴性对照水平。
其次，基于研究团队此前自主开发的融合蛋白通用逆折叠模型、结构与进化约束信息的蛋白定向进化平台AiCE，实现对Cre蛋白多聚化界面的精准优化，获得重组效率提升至3.5倍的工程化Cre蛋白变体。
最后，研究团队创建并优化了重组酶的无痕编辑策略Re-pegRNA，利用引导编辑器的高效编辑特性，通过设计特异性pegRNA对重组后残留的Lox位点进行“重引导编辑”，将其精准替换为原有基因组序列。
通过这三项技术的集成优化，研究团队成功构建PCE与RePCE两个可编程染色体编辑系统，可对不同Lox位点的插入位置和方向进行灵活编程，实现碱基从千比特(kb)到兆比特(Mb)尺度的大片段DNA精准无痕操纵。
研究团队表示，他们在动植物细胞中，利用新研发的系统已成功实现18.8kb超大片段DNA的定点整合、5kb序列的定向替换、12Mb的染色体倒位、4Mb的染色体删除及整条染色体的易位。他们还利用新型大片段DNA精准操纵技术，成功创制含315kb精准倒位的抗除草剂水稻种质，展示出其广泛应用前景。
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